Elutionsverfahren in der HPLC
Bemerkungen
- Das Spülen der Probe mit Hilfe des Fließmittels durch die HPLC-Säule,
wird als Elution bezeichnet.
- In der HPLC unterscheidet man zwei verschiedene
Elutionsverfahren:
Isokratische Elution
Bemerkungen
- Bei isokratischer Elution bleibt die Zusammensetzung des Fließmittels
während der gesamten Messung konstant.
- Dies ermöglicht relativ einfache Aufbauten, führt jedoch oft nicht zu
optimalen Trennergebnissen.
- Neben der oftmals schlechten Auftrennung der Probe sind oft auch sehr
lange Analysenzeiten nötig.
- Diese beiden Nachteile haben dazu geführt, dass die isokratische Elution
in der HPLC heute kaum noch eingesetzt wird.
- Ausnahme sind jedoch Aufbauten mit den sehr empfindlichen Brechungsindex-Detektoren,
die ausschließlich in Verbindung mit einer isokratischen Elution eingesetzt
werden können.
Gradienten-Elution
Bemerkungen
- Bei der Gradienten-Elution wird die Zusammensetzung des Fließmittels
während der Messung verändert. Die Veränderung kann schlagartig
durchgeführt werden, deutlich häufiger ist jedoch das langsame Umstellen
des Fließmittels - das "Fahren eines Gradienten", von dem sich
der Name ableitet.
- Meist werden Phasen, in denen ein Gradient gefahren wird und Phasen mit
isokratischer Elution kombiniert.
- Um eine bessere Auswertbarkeit zu erreichen, bemüht man sich oft,
dass die für eine quantitative Auswertung interessierenden Peaks in
isokratischen Phasen liegen, während die Gradienten-Phasen dazu dienen,
Substanzen, die sonst sehr lange in der Säule verbleiben würden,
schneller zu eluieren.
- Durch die Gradienten-Elution kann man so eine Verkürzung der einzelnen
Retentionszeiten sowie der gesamten Analysenzeit erreichen verkürzen und
die Auftrennung der Probe deutlich verbessern.
- Wird das Fleißmittelgemisch erst im unter Druck stehenden Teil der Anlage
gemischt, so spricht man von Hochdruck-Gradienten, findet die
Mischung des Fließmittels bereits vor dem Hochdruck-Teil statt, nennt man
dies Niederdruck-Gradienten.
- Vorteil des Niederdruck-Gradienten ist, dass auch bei der
Gradienten-Elution nur eine (relativ teure) HPLC-Pumpe eingesetzt werden
muss. Die Mischung des Fließmittels wird hier von preiswerteren
Niederdruckpumpen vorgenommen. So lassen sich auch komplexe Fließmittel
zu vertretbaren Kosten einsetzen.
- Beim Einsatz von Brechungsindex-Detektoren
ist keine Gradienten-Elution möglich.
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