Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie

High performance liquid chromatography (HPLC) [engl.], High pressure liquid chromatography [engl.], Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie

Prinzipiell der Säulenchromatographie vergleichbares Verfahren, bei dem sehr feinkörnige Adsorbentien als Säulenmaterial eingesetzt werden. Aufgrund der kleineren Zwischenkornvolumina und der höheren Kapillarkräfte muss mit erhöhtem Druck (100 - 400 bar) gearbeitet werden um eine effiziente Elution zu erreichen.

Entsprechend der normalen Säulenchromatographie wird die Trennung der Probe durch ein komplexes System von Wechselwirkungen zwischen den Eigenschaften der Probe, der mobilen und der stationären Phase bestimmt. Bei der Durchführung der HPLC spielen sowohl Verteilungs- als auch Adsorptionsphänomene eine entscheidende Rolle.
Ziel aller technischen Maßnahmen ist es, hohe Trennleistungen bei relativ kurzer Trennstrecke und Retentionszeiten zu erreichen.

Da sowohl qualitative, als auch quantitative Bestimmungen möglich sind, eignet sich die HPLC sowohl für Identitäts- und Reinheitsbestimmungen, als auch für Gehaltsbestimmungen.
Die HPLC stellt in der pharmazeutischen Industrie das gängigste analytische Verfahren für quantitative Bestimmungen dar. Dort konkurriert sie in vielen Bereichen mit der Gaschromatographie.

Die zu untersuchende Probe kann flüssig oder fest sein. Feststoffe müssen vor dem Einbringen in den Analysenautomaten gelöst werden.
Die flüssige Probe wird entweder manuell, mittels einer speziellen Dosiereinrichtung (Dosierschleife) dem unter Druck stehenden Fließmittel zugemischt und auf die Säule gegeben oder von sogenannten Autosamplern automatisch eingespritzt.
- Die Dosierschleife ermöglicht die Applikation genau definierter Mengen an Probelösung, indem sie ein genau definiertes Volumen enthält. Für verschiedene manuell eingespritzte Probevolumina sind also auch verschiedene Dosierschleifen notwendig.
- Moderne Autosampler können mit Hilfe von Dosierspritzen sämtliche Volumina von weniger als 10 µl bis etwa 100 µl sehr volumengenau ins System applizieren.
Die Säule enthält ein festes Adsorbens, an dem die chromatographische Trennung stattfindet. Das als Sorbens verwendete Material kann polare bis unpolare Eigenschaften besitzen.
Durch ständig nachgefördertes Fließmittel treten die einzelnen Bestandteile der Probe nach und nach aus der Säule aus und werden von einem Detektor aufgezeichnet (äußeres Chromatogramm).

Als Pumpen werden in der HPLC sogenannte Kolbenhubpumpen eingesetzt. Diese arbeiten weitestgehend pulsationsarm und können die verwendeten Drücke von bis zu 400 bar liefern.
Die Strömungsgeschwindigkeit lässt sich meist im Bereich von 0,1 - 10 ml/min variieren.

Das Fließmittel stellt die mobile Phase dar. Seine Auswahl erfolgt grundsätzlich anhand der eluotropen Reihe.
Bei der häufig verwendeten Umkehrphasen-Chromatographie (reversed phase chromatography) kehrt sich die eluotrope Reihe um. Daher hat Wasser dort die geringste Elutionskraft.
An die verwendeten Fließmittel werden hohe Anforderungen gestellt:
- Polarität
- Chemische Reinheit
- Niedrige Viskosität
- Keine Störsignale im Detektor
  - v.a. bei der späteren Auswertung durch UV-Detektoren von Bedeutung
- Frei von gelösten Gasen
  - Nicht ausreichend entgaste Fließmittel führen zu verstärktem Basislinienrauschen, schlecht reproduzierbaren Retentionszeiten und einer allgemein schlechteren Empfindlichkeit (vgl. Entgasung von Lösemitteln).
- Frei von Schwebstoffen
  - Schwebstoffe können die Säule verstopfen oder zumindest ihre Trennleistung beeinträchtigen. Außerdem sind die Ventile der HPLC-Pumpen relativ empfindlich gegenüber Verunreinigungen.
- Niedriger Dampfdruck
- Geringe Toxizität
Eingesetzt werden häufig auch Mischungen mehrerer Fließmittel, unter Umständen wird die Zusammensetzung des Fließmittels sogar während der Analyse verändert (vgl. Elutionsverfahren in der HPLC).

Grundmaterial der Trennsäulen ist meist Edelstahl, oftmals sind sie innen mit einem Glasmantel ausgekleidet. Bis zu Drücken von ca. 70 bar werden auch reine Glassäulen eingesetzt.
Analytische Säulen haben in der Regel Längen von 5 - 30 cm und Durchmesser von 2 - 6 mm.
Zum Schutz der eigentlichen Trennsäule vor Schwebstoffen (z.B. ungelöste Probenbestandteile) werden meist kleinere Vorsäulen als Filter vorgeschaltet.

Die Anforderungen an das Trennmaterial sind bei der HPLC deutlich höher, als bei der normalen Säulenchromatographie.
Entscheidende Kriterien sind:
- Korngröße
- Korngrößenverteilung
- Porengröße
- Oberflächenbeschaffenheit

Die Korngröße der verwendeten stationären Phase liegt sehr homogen um ca. 5 µm, ist damit also 5 - 20 mal geringer, als bei der Säulenchromatographie.
- Moderne Hochleistungssäulen haben Korngrößen von ca. 3 µm.
  - Der Trend geht zu noch geringeren Korngrößen (2004: 1,7 µm, "UPLC"), da so kürzere Analysenzeiten, höhere Auflösungen und Empfindlichkeiten erreicht werden können.
- Säulen mit ca. 7 µm oder 10 µm Korngröße werden kaum noch eingesetzt.

Als Normalphasen bezeichnet man stationäre Phasen, die aus polaren Sorbentien bestehen. Die wichtigsten Vertreter sind Kieselgele und Aluminiumoxid. Dabei ist zu beachten, dass Kieselgele im Alkalischen instabil sind.
Die eingesetzten Kieselgederivate tragen Nitril-, Amino- oder Diolgruppen.
Zu den Normalphasen werden auch Ionenaustauscher gezählt, die als Füllmaterial bei der Ionenchromatographie Verwendung finden.

Sogenannte RP-Phasen, von englisch "reversed phase", haben große Bedeutung erlangt. Sie werden in der Umkehrphasen-Chromatographie eingesetzt.
Es handelt es sich meist um Kieselgelderivate, die anstatt freier Silanol-Gruppen nun Alkylgruppen an ihrer Oberfläche aufweisen. Dies führt zu einer Umkehr seiner Eigenschaften von sehr polar zu apolar.
Häufig verwendete Alkylgruppen sind Octyl- (Handelsname: RP-8) oder Octadecyl-Reste (Handelsname: RP-18).
Neben dieser "Standard-Alkylierung", die bereits Änderungen der polaren Eigenschaften in großem Umfang ermöglicht, gibt es noch das so genannte "Polymer-Coating", bei der das Kieselgel von einer zusätzlichen Schicht aus einem Polymer umhüllt wird.
Die RP-Phasen ermöglichen eine gute Trennung von polaren und unpolaren Substanzen.

Qualitativ
- Die Auswertung erfolgt über die Retentionszeiten, die mit Vergleichssubstanzen verglichen werden.
Quantitativ
- Die Auswertung erfolgt gegen einen externen Standard anhand der Signalflächen.
- Auf einen internen Standard kann meist verzichtet werden.
- Der Einsatz des Standardadditionsverfahrens ist ebenfalls möglich.

Bessere Trennleistung und Auflösung aufgrund der deutlich größeren Oberfläche der stationären Phase und des reduzierten Totvolumens.
Deutlich kleinere Säulen, als in der klassischen Säulenchromatographie.
Kürzere Retentions- und Analysezeiten, da das Lösemittel mit Druck durch die Säule gepresst wird.
Sehr gute Reproduzierbarkeit der Trennungen.

Hoher technischer Aufwand, aufgrund der verwendeten hohen Drücke.
Höhere apparative Kosten, da spezielle Systeme erforderlich:
- Druckstabile und chemisch resistente Leitungen
- (Weitestgehend) pulsationsfrei arbeitende Pumpen
- Injektionsventile zur Probenaufgabe ins unter Druck stehende System
- Druckstabile Sorbentien