Isoelektrische Fokussierung (IEF)
Definition
Trennprinzip
- Probenauftrennung nach unterschiedlichen isoelektrischen Punkten.
Bemerkungen
Vorbereitung des Trenngels
- Bei der isoelektrischen Fokussierung weist die gesamte Trennstrecke einen pH-Gradienten.
- Dazu werden zunächst amphotere Polyaminocarbonsäuren ins Trenngel beigemischt.
- Anschließend wird der endgültige pH-Gradient dadurch erzeugt, dass im Anodenraum H+-Ionen,
im Kathodenraum OH--Ionen eingebracht werden und ein Strom
angelegt wird.
- Die Ampholyte und Ionen beginnen durch das angelegte Feld im Gel zu
wandern.
- An den Stellen, an denen sich die Ampholyte schließlich im Gel einlagern,
entsteht ein bestimmter pH-Wert.
Eigentliche Probentrennung
- Amphotere Teilchen wandern bei der eigentlichen Elektrophorese bis in den
Bereich, an dem der pH-Wert des Gels ihrem isoelektrischen Punkt entspricht.
Dort bleiben sie liegen, da sie nun nach außen ungeladen sind und folglich
die angelegte Spannung keinen Effekt mehr auf sie ausübt.
- Die Auswertung erfolgt entweder direkt mittels einer pH-Sonde oder
indirekt mit Hilfe von Markersubstanzen.
- Die isoelektrische Fokussierung liefert sehr scharfe Zonen und ermöglicht
die Erfassung von Differenzwerten im Bereich von 0,01 - 0,02 pH-Einheiten.
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