Gaschromatographie (GC)

Definition

• Chromatographisches Verfahren, bei dem als mobile Phase statt einer Flüssigkeit ein Gas eingesetzt wird. 

Messprinzip

• Die GC ist in erster Linie eine Verteilungschromatographie. Allerdings muss auch der Dampfdruck der Substanzen berücksichtigt werden.

Prinzip der GC

• Die Probe kann als Gas, Flüssigkeit oder gelöster Feststoff eingesetzt werden. Für Flüssigkeiten und gelöste Feststoffe gilt allerdings die Einschränkung, dass sie sich unter den gegebenen Bedingungen von ca. max. 400 °C verdampfen lassen.
• Die Probe wird, sofern sie nicht bereits gasförmig vorliegt, im Injektor verdampft. Je nach Dampfdruck geht dies schneller oder langsamer. 
• Die verdampfte Probe wird nun einem inerten Trägergas beigefügt und durch die Trennsäule gespült. Hier erfolgt nun die Trennung nach Lipophilie bzw. Hydrophilie.
• Die Auswertung erfolgt anhand der die Säule verlassenden Substanzen mittels eines Detektors (äußeres Chromatogramm)

Trägergas

• Das Trägergas, die mobile Phase der GC, dient dem Transport der Substanzen durch den Gaschromatographen. Ein ideales Trägergas sollte folgende Eigenschaften aufweisen:
  • chemisch inert
  • gute Trenneigenschaften (van-Deemter-Gleichung)
  • preiswert
  • nicht brennbar

Trägergas	Vorteile	Nachteile
Wasserstoff	preiswert, gute Trenneigenschaften	brennbar
Helium	gute Trenneigenschaften	teuer
Stickstoff	preiswert	schlechte Trenneigenschaften
Argon	gute Trenneigenschaften	teuer
Kohlendioxid	obsolet

• Die Zufuhr des Trägergases wird mittels Ventilen geregelt. Je nach der Einstellung kann man die Strömungsgeschwindigkeit variieren. 
• Je schneller das Gas strömt, desto kürzer werden zwar die Analysenzeiten, jedoch verschlechtert sich auch die Trennleistung, da weniger Zeit für die Einstellung des Verteilungsgleichgewichtes bleibt.
• In der GC werden keine Gemische von Trägergasen eingesetzt.

Injektor

• Sind die Proben nicht gasförmig, so müssen sie erst in den gasförmigen Zustand überführt werden. Dies geschieht im Injektor, bzw. im vorderen Teil der Säule.
• Split-Injektor
  • Die Probe wird mittels einer Mikroliterspritze durch ein Teflon-Septum in einer Kammer injiziert, dort verdampft und dem Trägergasstrom zugefügt.
  • Vor dem Verlassen des Injektors wird der Gasstrom mit Hilfe eines Ventils geteilt. Ein Teil geht auf die Trennsäule, der andere wird verworfen. 
  • Durch dieses Verfahren erhält man eine zusätzliche Verdünnung der Probe, eine Überladung der Säule wird also vermieden. Negativ ist jedoch, dass ein Teil der Probe ungenutzt verloren geht, was sich vor allem bei nur kleinen Probenmenge bemerkbar macht.
• On-Column-Injektor
  • Die Probe wird durch ein Ventil direkt auf die Säule gespritzt und verdampft dort langsam. Der Injektor dient also allein zur Einbringung der der Probe und Zumischung des Trägergases. Um eine Überladung der Säule zu vermeiden, dürfen nur wesentlich kleinere Probenmengen, als beim Split-Injektor aufgetragen werden, allerdings wird die Probe vollständig genutzt, was besonders bei nur kleinen Probenmengen von Vorteil ist. 
• Die Verdampfbarkeit der Probe stellt eine Grenze der Anwendbarkeit der GC dar. Ist eine Probe unter den gegebenen Bedingungen nicht flüchtig oder nicht stabil, so kann sie nicht ohne weiteres untersucht werden. In einigen Fällen kann die Probe jedoch durch Derivatisierung doch noch in eine bestimmbare Form überführt werden.
• Durch Veresterung, Veretherung, Silylierung und andere Verfahren, kann z.B. die Flüchtigkeit erhöht, die Zersetzung vermieden, eine Trennung von Enantiomeren ermöglicht oder die Detektierbarkeit (z.B. für ECD) erreicht werden.
• Beim Einsatz gasförmigere Proben kann die Head-Space-Technik angewandt werden. Eine flüssige Probe wird hierbei in einem geschlossenen Gefäß erwärmt. Zwischen dem Luftraum über der Flüssigkeit und der flüssigen Phase stellt sich ein Gleichgewicht ein. Die Probe wird nun aus dem Luftraum über der Probe entnommen und der GC zugeführt.

Säule

• In der GC werden zwei Säulentypen verwandt, man unterscheidet:
  • Gepackte Säulen
    • Gepackte Säulen sind 0,5 - 8 m lang und haben Innendurchmesser von 2 - 4 mm.
    • Als Packungsmaterial dienen Adsorbentien wie Kieselgel oder Aluminiumoxid. Kieselgur wird als Trägermaterial für schwer verdampfbare Flüssigkeiten (Trennflüssigkeit) benutzt.
    • Vorteilhaft bei gepackten Säulen ist ihre Belastbarkeit mit höheren Substanzmengen, allerdings ist ihre Trennleistung deutlich geringer als die von Kapillarsäulen. 
  • Kapillarsäulen
    • Kapillarsäulen sind 15 - 100 m lang und haben Innendurchmesser von ca. 0,1 mm.
    • Es werden zwei Untertypen unterschieden: Dünnfilmsäulen und Dünnschichtsäulen.
    • Bei den Dünnfilmsäulen ist auf die Kapillarinnenseite eine Trennflüssigkeit aufgebracht. Da sie nicht zusätzlich fixiert ist, neigen Dünnfilmsäulen zum "Ausbluten", dem Austritt der Trennflüssigkeit aus der Säule während der Aufnahme des Chromatogramms. Dies setzt ihre Haltbarkeit deutlich herab. Die Belastbarkeit von Dünnfilmsäulen liegt bei ca. 0,001 µl.
    • Dünnschichtsäulen enthalten auf der Kapillarinnenseite eine dünne Trägerschicht aus z.B. Aluminiumoxid oder Kieselgel. Auf diese Trägerschicht ist eine geringe Menge einer Trennflüssigkeit aufgetragen. Diese ist dort weitestgehend immobilisiert, so dass Dünnschichtsäulen praktisch nicht "ausbluten" und deutlich länger halten als Dünnfilmsäulen. Die Belastbarkeit von Dünnschichtsäulen beträgt ca. 0,01 - 0,1 µl.
• Als Trennflüssigkeiten kommen zahlreiche Verbindungen zum Einsatz, die sich in ihrer Lipophilie bzw. Hydrophilie unterscheiden. Gemeinsam ist ihnen ihre hohe Molmasse und damit ihr niedriger Dampfdruck. Meist handelt es sich um Polymere. Eingesetzte Stoffklassen sind Alkane / Paraffine, Silikonöle oder Polyethylenglykole. 
• Säulen ohne (immobilisierte) Trennflüssigkeiten kommen heute praktisch nur noch bei der Analyse von Gasgemischen zum Einsatz. 

Detektor

• Die drei am häufigsten verwendeten Detektoren sind: 
  • Flammenionisationsdetektor (FID)
    • Der von der Säule kommende Gasstrom wird in einer Knallgasflamme verbrannt. Zwischen den Brenner und einer Kollektorelektrode wird eine Spannung angelegt. Durch in der Flamme bei Elution einer Verbindung entstehende Ionen und Radikale wird ein Stromfluss erzeugt, der als Messsignal registriert wird.
    • Die Nachweisgrenze liegt bereits relativ niedrig. 
  • Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD)
    • Eine mit einem Temperaturfühler versehene Kammer wird allein vom Trägergas durchströmt. Eine andere, ansonsten baugleiche, Kammer vom Gasstrom aus der Säule. Gelangt aus der Säule ebenfalls nur das Trägergas in diese Zelle, so registrieren beide Fühler die gleiche Wärmeableitung. Befinden sich im Gasstrom der Säule jedoch Substanzen, so ändert sich die Wärmeleitfähigkeit des Gases und es tritt eine Temperaturdifferenz zwischen den Messfühlern auf. Diese wird als Messsignal aufgenommen.
    • Die Nachweisgrenze liegt etwas höher, als beim FID.
    • Eingesetzt wird der WLD vor allem bei der Verwendung von Wasserstoff als Trägergas, seltener auch noch bei Helium. Bei anderen Trägergasen spielt er praktisch keine Rolle.
  • Elektroneneinfangdetektor (EED) 
    • Synonym
      • electron capture detector (ECD)
    • Der Trägergastrom wird durch einen b-Strahler (z.B. ³H, ⁶³Ni) ionisiert.
    • Diese Ionisierung führt zu einem Grundstrom, der zwischen zwei Elektroden gemessen wird. Treten Substanzen aus der Säule, die Elektronen einfangen können, so wird der Grundstrom abgeschwächt. Diese wird messtechnisch aufgezeichnet und später ausgewertet.
    • Die Nachweisgrenze liegt sehr niedrig.
• Neben diesen drei Detektoren ist ferner die GC-MS von Bedeutung. Hier wird die Gaschromatographie mit der Massenspektrometrie gekoppelt. 

Chromatogramm

• Die genannten Detektoren liefern ein Signal, das der Schreiber in einen Peak im Chromatogramm umwandelt. Diese Signale werden gegen die Zeit aufgetragen. 
• Die Zeit nach der Injektion der Probe bis zum Auftreten des Signals wird als Gesamtretentionszeit t_m+s bezeichnet. Sie entspricht der Aufenthaltszeit der Substanz in stationärer und mobiler Phase. 
• Substanzen, die keinerlei Wechselwirkungen mit der stationären Phase zeigen, werden trotzdem nicht zum Zeitpunkt t = 0 registriert, da auch sie erst den Weg vom Injektor durch die Säule zum Detektor zurücklegen müssen. Diese Zeit, die der Aufenthaltszeit der mobilen Phase im System entspricht, wird als Totzeit bezeichnet. Die Totzeit einer BPI-Säule kann z.B. durch die Injektion von Methan bestimmt werden.

Trennstufenzahl / HETP

• Zur Charakterisierung der Trennleistung einer Säule wird die Trennstufenzahl n, bzw. die Trennstufenhöhe (HETP, "height equivalent of a theoretival plate") verwendet. Sie ist eine für jede Substanz charakteristische Größe, die von der Säule und den Trennbedingungen abhängt.
• Stellt man sich die Säule als Raum mit vielen kleinen Kammern vor, so strömt das Gas mit der Substanz in jede Kammer, wo sich ein Verteilungsgleichgewicht zwischen Gasraum und der Trennflüssigkeit einstellt. Je mehr Kammern es gibt, desto besser ist die Trennleistung und desto höher ist die Trennstufenanzahl bzw. desto niedriger ist die HETP.
• Die Trennstufenzahl lässt sich aus der Retentionszeit berechnen:

n	:	Trennstufenzahl
tm+s	:	Gesamtretentionszeit
b0,5	:	Halbwertsbreite

• Für die Trennstufenhöhe ergibt sich danach:

HEPT	:	Trennstufenhöhe ("height equivalent of a theoretical plate")
L	:	Länge der Säule
n	:	Trennstufenzahl

Van-Deemter-Gleichung

• Die van-Deemter-Gleichung wird als Grundgleichung der GC bezeichnet. Sie stellt den Zusammenhang zwischen Trennstufenhöhe und Strömungsgeschwindigkeit dar. 

HEPT	:	Trennstufenhöhe ("height equivalent of a theoretical plate")
A	:	Streudiffusion
B	:	Longitudinaldiffusion
C	:	Massenübertragung
u	:	Strömungsgeschwindigkeit

• Die Streudiffusion, auch als Eddy-Diffusion bezeichnet, tritt durch unregelmäßig gepackte Säulen mit unterschiedlichen Strömungsgeschwindigkeiten in den Hohlräumen auf. Sie sorgt für eine Zonenverbreiterung. Je größer die Hohlräume zwischen den einzelnen Partikeln der stationären Phase ist, desto stärker ist der durch die Streudiffusion entstehende negative Effekt. Ideal ist folglich eine homogene Packung der Säule mit möglichst kleinen Teilchen.
• Die Longitudinaldiffusion bezeichnet die Diffusion in Richtung der Trennstrecke. Sie kann durch hohe Trägergasgeschwindigkeiten klein gehalten werden.
• Die Massenübertragung bezieht sich auf die Geschwindigkeit mit der sich der Gleichgewichtszustand einstellt.
• Bei der Kapillar-GC sind Streu- und Longitudinaldiffusion zu vernachlässigen.
• Da die Terme B und C durch die Strömungsgeschwindigkeit (u) gegensätzlich beeinflusst werden, muss das Optimum der Trägergasgeschwindigkeit durch Vorversuche ermittelt werden. Trägt man die erhaltenen Werte für HEPT gegen die Strömungsgeschwindigkeit auf, so erhält man Kurven wie:
• BILD
• Jedes Trägergas weist einen unterschiedlichen Kurvenverlauf auf. Anhand der Kurve werden die unterschiedlichen Trenneigenschaften der Gase sichtbar. So zeigt Stickstoff nur ein schmales Minimum, weshalb sich Stickstoff nur schwer in der GC einsetzen lässt.
• Die van-Deemter-Gleichung ist weitgehend auch auf die HPLC übertragbar.

Qualitative Bestimmung

• Durch Vergleich der Retentionszeit mit einer Referenz ist eine Identifizierung von Substanzen möglich. Die Retentionszeit allein kann jedoch nicht aus Tabellen entnommen und verglichen werden, da sie von zahlreichen Faktoren abhängig ist:
  • Art und Länge der Säule
  • Operator
  • Art des Trägergases
  • Temperatur von Injektor, Detektor und Säule
  • Art des Detektors
  • Strömungsgeschwindigkeit
• Um diese Faktoren auszumitteln, wird die relative Retentionszeit gebildet:

trR	:	relative Retentionszeit
tR	:	Retentionszeit der Referenz
tS	:	Retentionszeit der Substanz

• Des weiteren wurde von Kovats eine Methode eingeführt, die diese Faktoren berücksichtigt. Der sogenannte Kovats-Index erlaubt die Identifizierung einer Substanz. Allerdings weisen oftmals verschiedene Substanzen den gleichen oder einen sehr ähnlichen Kovats-Index auf.
• ....
• Bei einem beliebigen Trennsystem wird zuerst eine Mischung verschieden langer n-Alkane getrennt. Der Logarithmus ihrer Nettoretentionszeit wird gegen die Kettenlänge mal Faktor 100 aufgetragen. Man erhält eine Gerade.
• Die Retentionszeit der Probe wird nun unter gleichen Bedingungen ermittelt. Zu der nun gemessenen Zeit wird anhand der Gerade eine theoretische Kettenlänge interpoliert. Dieser kann nun anhand von Tabellen eine Substanz zugeordnet werden.
• Sollten mehrere Substanzen in Frage kommen, so kann eine Identifizierung, z.B. durch die Zugabe einer geringen Menge der erwarteten Substanz und die Aufnahme eines weiteren Chromatogramms unter etwas veränderten Bedingungen, durchgeführt werden. Sind im erhaltenen Chromatogramm keine neuen Peaks zu erkennen und ist der Peak des zu identifizierenden Stoffs nun größer, so kann von Identität ausgegangen werden.
• Der Kovats-Index bezieht sich auf eine isotherme Arbeitsmethode, bei Temperaturprogrammen versagt er.
• Die Berechnung des Kovats-Index ist ebenfalls möglich:

  

I	:	Kovats-Index
x	:	Wert der gesuchten Substanz
z	:	Werte des Alkans mit kleinerer Retentionszeit
z+1	:	Werte des Alkans mit nächsthöherer Retentionszeit

Quantitative Bestimmung

• Die quantitative Bestimmung erfolgt gegen Standards. Zum einen wird ein externer Standard benutzt, der den zu bestimmenden Stoff in bekannter Konzentration enthält, zum anderen ein interner Standard, der einen beliebigen Stoff in einer bestimmten Konzentration enthält. Der interne Standard wird sowohl zur Proben- als auch zur Referenzlösung gegeben und ermöglicht später die Beseitigung falscher Ergebnisse durch Dosierungenauigkeiten bei der Substanzapplikation in den Automaten. Bei gegebenen Trennbedingungen wird einmal die Probe und einmal der Standard vermessen. Aus den Chromatogrammen kann die Fläche der Signale bestimmt und daraus der Gehalt der Probe ermittelt werden.
• Der Korrekturfaktor durch den internen Standard ergibt sich zu:

F	:	Korrekturfaktor
(AiS)R	:	Peakfläche des internen Standards in der Referenzmessung
(AiS)S	:	Peakfläche des internen Standards in der Probemessung

• Bei der quantitativen Bestimmung sind zusätzlich Unterschiede im Ansprechverhalten des Detektors auf verschiedene Substanzen (sog. "response factor") zu berücksichtigen.

Auflösung

• Die Auflösung stellt ein Maß für die Trennung zweier Signale dar. Das DAB berechnet sie nach folgender Formel:

RS	:	Auflösung
tm+s	:	Gesamtretentionszeit
b0,5	:	Peakbreite bei 50 % der Höhe

• Die Auflösung sollte für quantitative Bestimmungen größer als 1,4 sein.

Berechnung der Peakfläche

• Die Berechnung der Peakfläche kann nach unterschiedlichen Verfahren vorgenommen werden.
• Nur zur Berechnung symmetrischer Peaks eignet sich die Berechnung der Fläche als Produkt aus der Peakhöhe und der Halbwertsbreite, der Breite des Peaks auf halber Höhe.
• Bei asymmetrischen Peaks kann das Condall-Bosch-Verfahren angewandt werden:

A	:	Peakfläche
h	:	Höhe des Peaks
b0,15	:	Breite bei 15 % der Peakhöhe
b0,85	:	Breite bei 85 % der Peakhöhe

• Ein weiteres Verfahren ist das Ausschneiden und Wiegen der Peaks, das Gewicht ist proportional zur Fläche.
• Heute wird die Berechnung der Peakfläche meist direkt mittels Integration im Messgerät vorgenommen. 

Peaksymmetrie

• Im Idealfall folgen die erhaltenen Signale einer Normalverteilungskurve.
• Dieser Fall ist jedoch sehr selten; meist zeigen die Signale Abweichungen von der idealen Symmetrie.
• Steigt der Peak steil an und fällt nach dem Maximum schwächer ab, so spricht man von Tailing.
• Ist die ansteigende Signalflanke flacher, als die abfallende, so nennt man dies Heading oder Leading.
• Diese Verzerrungen machen eine Auswertung der Peaks mit Hilfe der einfacheren Methoden für symmetrische Peaks unmöglich. Hier müssen komplexere Verfahren angewandt werden.
• Die Symmetrie wird ausgedrückt über

  

Ss	:	Peaksymmetrie
b0,05	:	Peakbreite bei 5 % der Peakhöhe
A	:	Breite des Peaks vom Beginn zu seinem Maximum

• Ist S_s dabei gleich 1 so ist die Kurve symmetrisch, Werte über 1 deuten auf Tailing, Werte unter 1 auf Heading hin.
• Im Bereich zwischen 0,8 und 1,2 kann trotz gegebener Asymmetrie noch ausreichend genau mit den Auswertmethoden für symmetrische Kurven gearbeitet werden.

Temperaturprogramm

• Substanzen, die sich unter isothermen Bedingungen nicht oder nicht hinreichend genau auftrennen lassen, können evtl. durch Anwendung eines Temperaturprogramms getrennt werden.
• Hierbei wird die Temperatur der Säule, gemäß eines festgelegten Programms im Laufe der Analyse erhöht. So gelangen die leichter flüchtigen Verbindungen bereits zu einem Zeitpunkt in die Gasphase, zu dem die schwerer flüchtigen aufgrund der zu niedrigen Temperatur noch nicht verdampfen.
• Durch die Wahl eines geeigneten Temperaturprogramms lässt sich die Analysenzeit deutlich verkürzen, bei gleichzeitig besseren Ergebnissen, da die Peaks spitzer und somit besser auswertbar werden. 

Anwendungsgebiet

• Blutalkoholbestimmung
• Reinheits- und Gehaltsbestimmungen des DAB (z.B. Benzin, Vitamin E, etc.)
• Dopinganalyse
• Rückstandsanalytik in Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen
• u.v.m.

Geschichtliches

• Die ersten bekannten Versuche zum Prinzip der Gaschromatographie gehen auf das 16. Jahrhundert zurück. Im Jahre 1512 versuchte der Straßburger Wundarzt von Brunschwig die destillative Trennung von Alkohol-Wasser-Mischungen. Er destillierte diese Lösungen durch einen mit Olivenöl getränkten Schwamm und erhielt reinen Alkohol.
• Erst Mitte des 20. Jahrhunderts wurde die Gaschromatographie jedoch ein wichtiges analytisches Verfahren, das sowohl zu präparativer, als auch zu analytischer Trennung von Stoffgemischen eingesetzt wird.
• Die GC hat mittlerweile Einzug in praktisch alle analytischen Labors gefunden.