Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
Synonyme
- High performance liquid chromatography
- High pressure liquid chromatography
Definition
- Verfahren der Säulenchromatographie, bei der sehr feinkörnige Adsorbentien als Säulenmaterial eingesetzt werden. Aufgrund der kleineren Zwischenkornvolumina und der höheren Kapillarkräfte muss mit erhöhtem Druck (100 - 400 bar) gearbeitet
werden um eine effiziente Elution zu erreichen.
Messprinzip
- Entsprechend der normalen Säulenchromatographie wird die Trennung der Probe durch ein komplexes System von Wechselwirkungen zwischen den Eigenschaften der Probe, der mobilen und der stationären Phase bestimmt. Bei der Durchführung der HPLC
spielen sowohl Verteilungs- als auch Adsorptionsphänomene eine entscheidende Rolle.
- Ziel aller technischen Maßnahmen ist es, hohe Trennleistungen bei relativ kurzer Trennstrecke und Retentionszeiten zu erreichen.
Anwendungsbereich
- Da sowohl qualitative, als auch quantitative Bestimmungen möglich sind, eignet sich die HPLC sowohl für Identitäts- und Reinheitsbestimmungen, als auch für Gehaltsbestimmungen.
- Die HPLC stellt in der pharmazeutischen Industrie das gängigste analytische Verfahren dar. Dort konkurriert sie in vielen Bereichen mit der Gaschromatographie
.
Formen
- Normalphasen-Chromatographie
- Umkehrphasen-Chromatographie (Reversed phase chromatography)
- Ionenpaarchromatographie
- Ionenchromatographie
Ablauf
- Die zu untersuchende Probe kann flüssig oder fest sein. Feststoffe müssen vor dem Einbringen in den Analysenautomaten gelöst werden.
- Die flüssige Probe wird meist mittels einer speziellen Dosiereinrichtung (Dosierschleife) dem unter Druck stehenden Fließmittel zugemischt und auf die Säule gegeben. Die Dosierschleife ermöglicht dabei die Applikation genau definierter Mengen
an Probelösung.
- Die Säule enthält ein festes Adsorbens, an dem die chromatographische Trennung stattfindet. Das als Sorbens verwendete Material kann polare bis unpolare Eigenschaften besitzen.
- Durch ständig nachgefördertes Fließmittel treten die einzelnen Bestandteile der Probe nach und nach aus der Säule aus und werden von einem Detektor aufgezeichnet (äußeres Chromatogramm
).
Säule
- Grundmaterial der Trennsäulen ist meist Edelstahl, oftmals sind sie innen mit einem Glasmantel ausgekleidet. Bis zu drücken von ca. 70 bar werden auch reine Glassäulen eingesetzt.
- Analytische Säulen haben in der Regel Längen von 5 - 30 cm und Durchmesser von 2 - 6 mm.
- Zum Schutz der eigentlichen Trennsäule vor Schwebstoffen (z.B. ungelöste Probenbestandteile) werden meist kleinere Vorsäulen als Filter vorgeschaltet.
Säulenfüllung / Stationäre Phase
- Die Anforderungen an das Trennmaterial sind bei der HPLC deutlich höher, als bei der normalen Säulenchromatographie
.
- Entscheidende Kriterien sind:
- Korngröße
- Korngrößenverteilung
- Porengröße
- Oberflächenbeschaffenheit
- Nomalphase
n
- Als Normalphasen bezeichnet man stationäre Phasen, die aus polaren Sorbentien bestehen. Die wichtigsten Vertreter sind Kieselgele und Aluminiumoxid. Dabei ist zu beachten, dass Kieselgele im Alkalischen instabil sind.
- Die eingesetzten Kieselgederivte tragen Nitril-, Amino- oder Diolgruppen.
- Zu den Normalphasen werden auch Ionenaustauscher
gezählt, die als Füllmaterial bei der Ionenchromatographie
Verwendung finden.
- Umkehrphasen / RP-Phasen
- Sogenannte RP-Phasen, von englisch "reversed phase", haben große Bedeutung erlangt. Sie werden in der Umkehrphasen-Chromatographie eingesetzt.
- Es handelt es sich meist um Kieselgelderivate, die anstatt freier Silanol-Gruppen nun Alkylgruppen an ihrer Oberfläche aufweisen. Dies führt zu einer Umkehr seiner Eigenschaften von sehr polar zu apolar.
- Häufig verwendete Alkylgruppen sind Octyl- (Handelsname: RP-8) oder Octadecyl-Reste (Handelsname: RP-18).
- Neben dieser "Standard-Alkylierung", die bereits Änderungen der polaren Eigenschaften in großem Umfang ermöglicht, gibt es noch das sogenannte "Polymer-Coating", bei der das Kieselgel von einer zusätzlichen Schicht aus
einem Polymer umhüllt wird.
- Die RP-Phasen ermöglichen eine gute Trennung von polaren und unpolaren Substanzen.
- Die Korngröße der verwendeten stationären Phase liegt sehr homogen um ca. 10 µm, ist damit also 5 - 20 mal geringer, als bei der Säulenchromatographie
.
Fließmittel / Mobile Phase
- Das Fließmittel stellt die mobile Phase dar. Seine Auswahl erfolgt grundsätzlich anhand der eluotropen Reihe
.
- An die verwendeten Fließmittel werden hohe Anforderungen gestellt:
- Polarität
- Chemische Reinheit
- Niedrige Viskosität
- Keine Störsignale im Detektor
- v.a. bei der späteren Auswertung durch UV-Detektoren von Bedeutung
- Frei von Luftsauerstoff
- Frei von Schwebstoffen
- Niedriger Dampfdruck
- Geringe Toxizität
- Bei der häufig verwendeten Umkehrphasen-Chromatographie kehrt sich die eluotrope Reihe
um. Daher hat Wasser nun die geringste Elutionskraft.
- Eingesetzt werden häufig auch Mischungen mehrerer Fließmittel, unter Umständen wird die Zusammensetzung des Fließmittels sogar während der Analyse verändert (Gradientenelution).
- Um die Freiheit von Luftsauerstoff und Schwebstoffen zu garantieren, werden die Fließmittel unmittelbar vor der Verwendung entgast und durch eine Fritte filtriert.
HPLC-Pumpe
- Als Pumpen werden in der HPLC sogenannte Kolbenhubpumpen eingesetzt. Diese arbeiten weitestgehend pulsationsarm und können die verwendeten Drücke von bis zu 400 bar liefern.
- Die Strömungsgeschwindigkeit lässt sich meist im Bereich von 0,1 - 10 ml / min variieren.
Gradientenmischer
- In der HPLC wird zwischen isokratischer und Gradienten-Elution unterschieden.
- Bei isokratischer Elution bleibt die Zusammensetzung des Fließmittels während der gesamten Messung konstant. Dies führt oft jedoch nicht zu optimalen Trennergebnissen.
- Bei der Gradienten-Elution wird die Zusammensetzung des Fließmittels während der Messung verändert. Dadurch lassen sich die Retentionszeiten verkürzen und die Trennung der Probe deutlich verbessern.
Trennbare Substanzmenge
- Bei präparativem Einsatz: wenige Milligramm
- Im analytischen Einsatz: µg- bis ng-Bereich
Detektoren
- Fast alle analytischen Bestimmungsverfahren können als Detektor in der HPLC Verwendung finden:
- UV-Vis-Detektoren
- Am häufigsten eingesetzter Typ, da viele Verbindungen chromophore Systeme
aufweisen.
- Der Aufbau entspricht einem Zweistrahl-UV-Vis-Spektrometer, bis auf die Tatsache, dass hier die Vermessung der Probe (des Eluats) in einer Durchflussküvette erfolgt.
- Durch den Einsatz von DADs (Diode Array Detector), also der Kopplung mehrerer Detektoren können mehrere Wellenlängen gleichzeitig vermessen werden.
- Fluoreszenzdetektoren
- Vorteile des Fluoreszenzdetektors sind seine niedrige Nachweisgrenze und seine hohe Selektivität. Allerdings zeigen nur relativ wenige Substanzen Fluoreszenz, so dass sein Anwendungsgebiet beschränkt bleibt.
- Der Aufbau entspricht dem eines Fluoreszenzspektrometers.
- Chemische Reaktionsdetektoren
- Die die Säule verlassenden Substanzen werden in diesem Detektor chemisch derivatisiert, so dass ihnen Chromophore
oder Fluorophore eingebaut werden. Dazu wird dem Fließmittelstrom ein entsprechendes Reagenz hinzugefügt.
- Die endgültige Auswertung erfolgt mit Hilfe von UV-Vis- oder Fluoreszenzdetektoren.
- Brechzahldetektoren / Refraktionsdetektoren
- Dieser Detektortyp vermisst kontinuierlich den Brechungsindex, des die Säule verlassenden Fließmittelstroms.
- Er ist universell einsetzbar, eignet sich jedoch nur bei isokratischer Elution.
- Leitfähigkeitsdetektoren (LFD)
- Einsatzgebiet ist primär die Ionenchromatographie
.
- Die Funktionsweise entspricht einem Konduktometer.
- Elektrochemische Detektoren
- Elektrochemische Detektoren untersuchen kleine Volumina des austretenden Fließmittelstroms mit Hilfe voltammetrischer Techniken. Meist wird dabei auf die Amperometrie
zurückgegriffen.
- Massenselektive Detektoren
- An die Trennung der Probe in der Säule werden die gewonnenen Fraktionen mit Hilfe eines Massenspektrometers untersucht.
- Der Aufwand der Kopplung ist hier größer, als bei der Kopplung der Gaschromatographie mit der Massenspektrometrie, da das Fleißmittel zuerst beseitigt werden muss.
- Polarimetrische Detektoren
- Polarimetrische Detektoren sind einsetzbar bei optisch aktiven Substanzen.
- Wird die Probe nicht kontinuierlich vermessen, so müssen, um schmale Banden zu erhalten, möglichst kleine Zellvolumina bei der Detektion vorliegen.
Auswertung von Chromatogrammen
- Qualitativ
- Die Auswertung erfolgt über die Retentionszeiten, die mit Vergleichssubstanzen verglichen werden.
- Quantitativ
- Die Auswertung erfolgt gegen einen externen Standard anhand der Signalflächen.
- Auf einen internen Standard kann meist verzichtet werden.
- Der Einsatz des Standardadditionsverfahrens
ist ebenfalls möglich.
Vorteile gegenüber der Säulenchromatographie
- Bessere Trennleistung und Auflösung aufgrund der deutlich größeren Oberfläche der stationären Phase und des reduzierten Totvolumens.
- Deutlich kleinere Säulen, als in der klassischen Säulenchromatographie
- Kürzere Retentions- und Analysezeiten, da das Lösemittel mit Druck durch die Säule gepresst wird.
- Sehr gute Reproduzierbarkeit der Trennungen.
Nachteile gegenüber der Säulenchromatographie
- Hoher technischer Aufwand, aufgrund der verwendeten hohen Drücke.
- Höhere apparative Kosten, da spezielle Systeme erforderlich:
- Druckstabile und chemisch resistente Leitungen
- Pulsationsfrei arbeitende Pumpen
- Injektionsventile zur Probenaufgabe ins unter Druck stehende System
- Druckstabile Sorbentien
Pharmazeutische Anwendung
- Bestimmung der Opiumalkaloide in Opiumtinktur
- Reinheitsprüfung von Insulin
- Reinheitsprüfung von Oxytocin
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