Fluorimetrie

Definition

• Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von fluoreszierenden Substanzen.

Messprinzip

• Messung der durch Fluoreszenz emittierten Strahlung einer Substanz nach vorheriger Anregung.
• Für die Intensität des zu messenden Lichts gilt folgender Zusammenhang:

IF	:	Intensität der Fluoreszenz
Fk	:	stoffspezifische Quantenausbeute
I0	:	eingestrahlte Lichtintensität
e	:	molarer Extinktionskoeffizient
c	:	molare Konzentration
d	:	Schichtdicke der Probe

• Die Messung findet meist im Vis- oder NIR-Bereich statt, die Messung einer Fluoreszenz im UV-Bereichs wird seltener verwendet.

Aufbau

• BILD
• Die Anregung wird meist mit Licht einer Wellenlänge von 365 nm vorgenommen, was einer der Spektrallinien der Quecksilberdampflampe entspricht.

Auswertung

• Messverfahren der Wahl ist das Standardadditionsverfahren. Dessen Auswertung erfolgt entweder graphisch oder rechnerisch, nach folgender Formel:

mS	:	Masse der Probe pro Volumeneinheit
IS	:	Intensität der Fluoreszenz der Probe
IBl	:	(mittlerer) Blindwert
IAdd	:	Intensität der Lösung mit zugesetztem Standard
mAdd	:	Masse des zugesetzten Standards
VS	:	eingesetztes Volumen der Probe
VAdd	:	zugesetztes Volumen des Standards

Bemerkungen

• Um etwaige Eigenfluoreszenzen durch Lösemittel oder andere Reagenzien aus dem Messwert zu kompensieren, muss der Messwert durch eine zusätzliche Blindwertmessung korrigiert werden.
• Da es keinen spezifischen Fluoreszenzfaktor gibt, müssen für quantitative Bestimmungen immer Vergleichsmessungen durchgeführt werden.
• Die Verwendung von Kunststoffgeräten sollte vermieden werden, da diese u.U. schwermetallhaltige Weichmacher enthalten können. Schwermetall-Ionen können aus dem Kunststoff in die Lösung freigesetzt werden und dort die Fluoreszenz stören. 
• Fluorophore Systeme enthalten im Allgemeinen mindestens zwei aromatische Ringe und mindestens einen zusätzlichen Elektronendonator.
• Wird bei kürzeren Wellenlängen gemessen, so zeigen auch Systeme mit kleineren chromophoren Systemen eine Fluoreszenz.
• Die Fluoreszenz liefert "kontinuierliche" Spektren, nicht nur einzelne Linien.
• Einige Ionen, z.B. Chlorid oder Hydroxyl, verhindern bzw. löschen in höherer Konzentration die Fluoreszenz. Sie werden als Quencher bezeichnet.

Leistungsbewertung

• Im Vergleich zur UV-Vis-Spektrometrie weist die Fluorimetrie eine höhere Selektivität auf, da nur wenige Substanzen eine Fluoreszenz aufweisen.
• Die Bestimmungsgrenze ist geringer, die Nachweisgrenze besser als die der UV-Vis-Spektrometrie.
• In Bezug auf die Robustheit ist die Fluorimetrie mit der UV-Vis-Spektrometrie vergleichbar.
• Die Nachweisgrenze ist extrem gering, theoretisch lässt sich noch ein einzelnes Molekül nachweisen.

Pharmazeutische Anwendung

• Bestimmung von:
  • Chinin
  • Chinidin
  • Cumarin
  • Ethacridin
  • Riboflavin
  • Triamteren
  • Thiamin (nach Umsetzung zu Thiochrom)

   

• Siehe auch:
  • Fluoreszenz
  • UV-Vis-Spektrometrie