Affinitätschromatographie

Chromatographisches Verfahren, bei dem die Auftrennung des zu analysierenden Gemisches durch unterschiedliche Affinitäten der Bestandteile zur stationären Phase erreicht wird.

Eigentlich handelt es sich bei der Affinitätschromatographie weniger eine Chromatographietechnik, als vielmehr um ein selektives Trennungsverfahren, mit dem man einzelne Substanzen relativ einfach und sehr rein aus komplexen Stoffgemischen extrahieren kann.

Das Adsorbens wird zunächst durch Kupplung mit einem spezifischen Liganden (z.B. einem Enzym, dessen Substrat, einem Antigen oder Hormon) so vorbereitet, dass es nun ein bestimmtes Makromolekül besonders stark zurückhält und bindet. Die so vorbereitete stationäre Phase bezeichnet man auch als Affinitätsmatrix.
Der am Adsorbens fest gebundene Ligand geht nun nur mit solchen Molekülen der Probe größere Wechselwirkungen ein, die selektiv an ihn binden können. Andere Moleküle werden nahezu nicht zurückgehalten und somit rasch von der Säule gespült.
Die zurückgehaltenen Verbindungen können anschließend mit einem anderen Fließmittel, durch das sich ihre chemischen Eigenschaften ändern, oder zu dem sie eine besonders hohe Affinität haben, von der Säule gewaschen werden.
Im Gegensatz zur prinzipiell gleich aufgebauten Ionenchromatographie beruhen die Wechselwirkungen zwischen Probe und stationärer Phase hier nicht auf Ladungseffekten, sondern eher auf der Ausbildung anderer Bindungseffekte wie Wasserstoffbrücken, Van-der-Waals-Kräfte etc.

Der Aufbau entspricht im allgemeinen der Säulenchromatographie, bei höheren Ansprüchen an die Trennleistung auch der HPLC.

Als stationäre Phase dient eine unlösliche Matrix, z.B. aus Agarose oder vernetzten Dextranen, an die kovalent ein Ligand gebunden ist, zu dem ein Bestandteil der Probe eine hohe Affinität aufweist.
Damit die reversible Bindung der Probe an den als "Pseudosubstrat" dienenden Liganden nicht behindert wird, werden zwischen Ligand und den Träger meist einige Methylgruppen als Spacer eingebracht.
Bei der Auftrennung von Enzymen sollte der eingesetzte Ligand nicht genau dem natürlichen Substrat entsprechen, da dieses sonst umgesetzt werden könnte. Es sind vielmehr Strukturanaloga zu verwenden, die zwar vom Enzym gebunden, aber nicht umgesetzt werden können. Diese Bedingung wird z.B. von einigen Farbstoffen erfüllt, so bindet z.B. Cibaron Blau Kinasen, Dehydrogenasen und andere Enzyme, die in vivo Adenylyl-enthaltende Substrate umsetzen.
Die Elution erfolgt bei der Auftrennung von Enzymgemischen meist mit einer Lösung, die den freien Cofaktor des jeweiligen Enzyms enthält.

Die Affinitätschromatographie ist generell immer dann geeignet, wenn mindestens ein Bestandteil der Probe eine besondere Affinität zum an der Säule gebundenen Substrat besitzt, die daraus resultierende Bindung reversibel ist und keine anderen störenden Reaktionen während der Trennung ablaufen.
Sie dient vor allem zur Isolation bestimmter Enzyme aus Gemischen und weniger als rein analytisches Verfahren.
Geeignet ist sie auch zur Reinigung von Antigenen, Antikörper, Vitaminen, Hormonen, polyribosomaler Komplexe u.a.