Fluorimetrie

Synonym

  • Fluoreszenz-Spektrometrie, Spektrofluorimetrie

Definition

  • Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von fluoreszierenden Substanzen.

Messprinzip

  • Dass Messprinzip ist die Messung der durch Fluoreszenz emittierten Strahlung einer Substanz nach vorheriger Anregung.
  • Die Anregung erfolgt normalerweise durch Licht mit höherer Frequenz als das später emittierte. Meist wird mit UV-Licht angeregt und dann das Fluoreszenzsignal im sichtbaren Bereich oder im NIR ausgewertet. Es sind jedoch auch Messungen im UV-Bereich möglich.
  • Für die Intensität des zu messenden Lichts gilt folgender Zusammenhang:

IF : Intensität der Fluoreszenz
Φk : stoffspezifische Quantenausbeute
I0 : eingestrahlte Lichtintensität
ε : molarer Extinktionskoeffizient
c : molare Konzentration
d : Schichtdicke der Probe
  • Normalerweise wird die nach Anregung mit einer konstanten Wellenlänge emittierte Fluoreszenz gemessen. Dieses Verfahren liefert "kontinuierliche" Emissionsspektren.
  • Alternativ kann auch die Anregung bei unterschiedlichen Wellenlängen erfolgen und die auf die jeweilige Anregungswellenlänge erfolgende Fluoreszenzantwort aufgezeichnet werden. Summiert man die Fluoreszenzantworten für die jeweiligen Wellenlängen und trägt sie gegen die Anregungswellenlänge auf, so erhält man ein Anregungsspektrum (excitation spectrum).

Aufbau

  • [BILD]
  • Bei einem klassisch aufgebauten Fluorimeter erfolgen Anregung und Fluoreszenzmessung senkrecht zueinander.
    • Dadurch trifft das eingestrahlte Licht normalerweise (außer durch Streuung) nicht auf den Detektor, der so nur das tatsächlich durch Fluoreszenz entstehende und in alle Richtungen abgestrahlte Licht empfängt.
    • Das Signal-Rausch-Verhältnis wird so erheblich verbessert (etwa um Faktor 105 verglichen mit einem nur Monochromatoren zur Trennung von Anregungs- und Fluoreszenz-Wellenlänge verwendenden System mit einer 180°-Anordnung von Lichtquelle und Detektor.
  • Bei einigen Geräten findet man auch andere Winkel zwischen Anregungslichtquelle und Detektor. 
    • Insbesondere Geräte zur Messung trüber Proben verwenden häufig sehr spitze Winkel zwischen Anregungslichtquelle und Detektor.
  • Einfache Fluoreszenz-Spektrometer können z.T. nur bei bestimmten Wellenlängen anregen. Diese werden über die Art der Anregungslichtquelle und zusätzliche Farbfilter vorgegeben. Diese dienen hier auch häufig zum Herausfiltern des Fluoreszenzanteils aus evtl. Streulicht.
  • Bessere Geräte verwenden Monochromatoren zur Auswahl der Anregungs- und Messwellenlänge.
  • Als Anregungslichtquellen kommen meist zum Einsatz:
    • Quecksilberdampflampen
      • Ältere Geräte verwenden häufig Quecksilberdampflampen als Lichtquelle. Da diese relativ preiswert sind, findet man sie auch heute noch in sehr einfachen Geräten.
      • Die typische Anregungswellenlänge dieser Geräte beträgt 365 nm, was einer der Spektrallinien einer Quecksilberdampflampe entspricht.
      • Andere Wellenlängen werden meist mit Hilfe von Filtern ausgewählt, jedoch sind aufgrund des Linienspektrums von Quecksilberdampflampen nicht alle Anregungswellenlängen möglich.
    • Xenon-Lampen
      • Xenon-Lampen emittieren über einen Bereich von 300 - 800 nm Licht mit relativ konstanter Intensität. Ihre Lichtstärke ist meist auch noch in Bereich hinab bis 200 nm ausreichend.
      • Kombiniert mit Monochromatoren, wie Gittern oder Prismen, lassen sich praktisch alle Wellenlängen ihres Spektralbereiches als Anregungswellenlängen auswählen und einsetzen.
    • Laser
      • Beim Einsatz eines Lasers als Anregungslichtquelle benötigt man aufgrund des sehr engen Frequenzspektrums eines Lasers meist keinen weiteren Monochromator im Strahlengang vor der Probe. Ausnahmen sind Laser mit mehreren Emissionswellenlängen.
      • Vorteilhaft gegenüber Xenon-Lampen ist ihr extrem enges Wellenlängenspektrum, das Messungen bei Bandbreiten von unter 1 nm ermöglicht. Als Nachteil ist ihre geringe Flexibilität bei der Auswahl der Anregungswellenlänge zu nennen.
  • Für bestimmte Messverfahren werden eingestrahltes und von der Probe emittiertes Licht zusätzlich durch Polarisationsfilter geleitet. So lassen Informationen über Gewicht und Größe der fluoreszierenden Strukturen erhalten (vgl. Fluoreszens-Polarisations-Assay, FPA).
  • Der eigentliche Detektor ist meist ein Photomultipliersystem, das den gewählten Emissionsbereich der Probe in ein Signal integriert aufzeichnet. Mehrkanalige Detektoren, z.B. Dioden-Array-Detektoren können prinzipiell ebenfalls eingesetzt werden, finden aber bisher weniger Verwendung. 

Auswertung

  • Bis zu einer gewissen Konzentration des Fluorophors in der Probe, kann von einer Proportionalität zwischen Konzentration und Fluoreszenzsignal ausgegangen werden.
  • Dieser Zusammenhang ist wird mit steigender Konzentration zunehmend durch andere Effekte, z.B. sogenannte innere Filtereffekte gestört
    • Ein Teil der emittierten Fluoreszenz kann durch andere Bestandteile der Probe (evtl. sogar durch andere Bereiche des gleichen Moleküls) absorbiert werden (Reabsorption) und so nicht mehr zum Detektor gelangen.
    • Bei sehr hohen Konzentrationen kann auch das bis zu den von Detektor erfassten Molekülen gelangende Anregungslicht bereits durch vorherige Interaktionen soweit abgeschwächt sein, dass hier nicht mehr alle Fluorophore angeregt werden und somit das erhaltene Signal schwächer ist, als eigentlich aufgrund der Konzentration zu erwarten.
  • Für die quantitative Auswertung wird meist das Standardadditionsverfahren verwendet. Dessen Auswertung erfolgt entweder graphisch oder rechnerisch, nach folgender Formel:

    mS : Masse der Probe pro Volumeneinheit
    IS : Intensität der Fluoreszenz der Probe
    IBl : (mittlerer) Blindwert
    IAdd : Intensität der Lösung mit zugesetztem Standard
    mAdd : Masse des zugesetzten Standards
    VS : eingesetztes Volumen der Probe
    VAdd : zugesetztes Volumen des Standards
  • Neben den oben angesprochenen inneren Filtereffekten gehen weitere Faktoren in ein gemessenes Fluoreszenzspektrum ein, die eine Standardisierung von Fluoreszenzspektrum erschweren.
  • Dazu gehören u.a. Faktoren wie tatsächliche Intensität der Anregungslichtquelle bei der gewählten Wellenlänge, effektive Breite des eingestrahlten und gemessenen Wellenlängenspektrums, Veränderungen innerhalb der Probe während und durch die Messung sowie Streuungseffekte (insbesondere Rayleigh- und Raman-Streuung).
    • Rayleigh-Streuung führt zu Streulicht mit der gleichen Wellenlänge, wie das gestreute Licht. 
    • Das durch Raman-Streuung entstehende Licht hat normalerweise eine größere Wellenlänge als das gestreute Licht. Raman-Streuung entsteht, wenn das zu streuende Licht, Elektronen im Molekül auf ein "virtuelles" erhöhtes Energieniveau hebt, von dem sie anschließend unter Lichtaussendung wieder herunterfallen, ohne dabei jedoch ihren vorherigen Zustand wieder komplett anzunehmen. In Fluoreszenzspektren findet man Raman-Streuung stets in einem konstanten Wellenzahlabstand zur Anregungswellenlänge.

Bemerkungen

  • Um etwaige Eigenfluoreszenzen durch Lösemittel oder andere Reagenzien aus dem Messwert zu kompensieren, muss der Messwert durch eine zusätzliche Blindwertmessung korrigiert werden.
  • Da es keinen spezifischen Fluoreszenzfaktor gibt, müssen für quantitative Bestimmungen immer Vergleichsmessungen durchgeführt werden.
  • Die Verwendung von Kunststoffgeräten sollte vermieden werden, da diese u.U. schwermetallhaltige Weichmacher enthalten können. Schwermetall-Ionen können aus dem Kunststoff in die Lösung freigesetzt werden und dort die Fluoreszenz stören. 
  • Fluorophore Systeme enthalten im Allgemeinen mindestens zwei aromatische Ringe und mindestens einen zusätzlichen Elektronendonator.
  • Wird bei kürzeren Wellenlängen gemessen, so zeigen auch Systeme mit kleineren chromophoren Systemen eine Fluoreszenz.
  • Die Fluoreszenz liefert "kontinuierliche" Spektren, nicht nur einzelne Linien.
  • Einige Ionen, z.B. Chlorid oder Hydroxyl, verhindern bzw. löschen in höherer Konzentration die Fluoreszenz. Sie werden als Quencher bezeichnet.

Leistungsbewertung

Pharmazeutische Anwendung

 

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