Rasterelektronenmikroskop (REM)

Synonym

  • Scanning Electron Microscope (SEM) [engl.]

Definition

  • Rasterelektronenmikroskope sind Elektronenmikroskope, bei denen der Elektronenstrahl in Form eines Rasters über das vergrößert abzubildende Objekt geführt wird und die Wechselwirkungen der Elektronen mit dem Objekt an jedem einzelnen Punkt des Rasters zur Zusammensetzung eines Gesamtbildes des Objekts genutzt werden.

Bemerkungen

  • Rasterelektronenmikroskope erzeugen Bilder der Objektoberfläche. Im Vergleich zu Bildern, die mit Durchlichtmikroskopen erzeugt werden, weisen diese eine erheblich höhere Schärfentiefe auf.
  • Der maximale theoretische Vergrößerungsfaktor liegt etwa bei 2.000.000 : 1, während der von Lichtmikroskopen bei etwa 2.000 : 1 liegt.
  • Hinsichtlich der Vergrößerung sollte jedoch folgendes bedacht werden: 
    • Die Vergrößerung sagt allein etwas darüber aus, wie das Verhältnis der abgerasterten Objektgröße zur angezeigten Bildgröße ist! Würde man eine Fläche von 5 x 5 µm2 in 2500 Punkte zerlegen und diese auf einer Fläche von 10 x 10 cm2 anzeigen, so hätte man eine Vergrößerung von Faktor 20.000. Bei einer Anzeigefläche von 100 x 100 cm2 wäre es jedoch eine 200.000fache Vergrößerung. In beiden Fällen würde die eigentliche Bildinformation jedoch nur aus 2500 Punkten bestehen, nur dass diese im letzteren Fall eben deutlich größer wären... Bei REM-Bildern ist daher unbedingt ein Maßstab ins Bild mit aufzunehmen bei der Anschaffung von REMs auf die tatsächlich erreichbare Rasterauflösung zu achten - da diese tatsächlich die maximal erreichbare Vergrößerung beeinflusst. 

Grundlagen

Technischer Aufbau und Prinzip

  • Rasterelektronenmikroskope (REM) und Transmissionselektronenmikroskope (TEM) sind hinsichtlich der Elektronenerzeugung und Elektronenlinsen weitgehend baugleich. Ein wesentlicher Unterschied besteht jedoch darin, dass die vorhandenen Linsen beim REM nicht der Abbildung dienen, sondern als Kondensorlinsen dienen, die den Elektronenstrahl vor dem Auftreffen auf die Probenoberfläche extrem stark zu bündeln sollen.
  • Um Wechselwirkungen mit Atomen und Molekülen in der Luft zu vermeiden, findet dieser Vorgang normalerweise im Hochvakuum statt.
    • Neuere Modelle ermöglichen jedoch z.T. auch Messungen in weniger stark evakuierten Probenräumen, wobei allerdings die Auflösung sinkt.
  • Der benötigte Elektronenstrahl wird von einer Elektronenquelle erzeugt.
    • Konventionelle Systeme benutzen dazu meist eine Glühkathode - einen haarnadelförmig gebogenen Glühdraht aus Wolfram oder Lanthanborid (LaB6). Beim Erhitzen emittiert die Glühkathode Elektronen, die dann in einem elektrischen Feld mit einer Spannung von typischerweise 8 - 30 kV beschleunigt werden.
    • Moderne Hochleistungsgeräte benutzen als Elektronenquelle sogenannte Feldemissionselektronenkanonen (Field Emission Gun, FEG). Diese besitzen eine sehr feine Spitze aus der die Elektronen in einem sehr dünnen Strahl heraustunneln. Instrumente mit einer solchen Elektronenquelle zeichnen sich durch eine besonders gute Bildqualität bereits bei niedriger Beschleunigungsspannung aus. Nur sie erreichen Vergrößerungsfaktoren von über 1.000.000 : 1.
  • Mit Hilfe von kreuzförmig angeordneten magnetischen Ablenkspulen wird der fein gebündelte Elektronenstrahl beim Mikroskopieren zeilenweise über die Präparatoberfläche geführt (Raster- bzw. Scan-Verfahren).
  • Das Präparat liegt unterhalb der letzten Linse auf einem Präparathalter, der durch entsprechende, vakuumdichte mechanische Triebe von außen in jede beliebige Richtung, Höhe und Neigung verstellt werden kann.
  • Trifft der Elektronenstrahl auf das Objekt, so kann es zu verschiedenen Interaktionen kommen.
  • Je nach gewählter Detektion und Auswertung können so verschiedene Informationen über die Beschaffenheit des betrachteten Objekts erhalten werden.
    • Die Standarddetektion ist die Messung von Sekundärelektronen, also aus der Probe durch den Primärelektronenstrahl ausgelösten Elektronen (s.u.).
  • Die Intensität der detektierten Signale an den einzelnen Punkten des Rasters, auf die der Elektronenstrahl fokussiert war, wird nun z.B. als Grauwert in den entsprechenden Pixel auf dem Bildschirm dargestellt.
  • Ein Problem bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung von elektrisch nicht oder nur schlecht leitenden Proben (Isolatoren) stellen Aufladungseffekte dar.
    • Ist die Energie der Elektronen zu niedrig, werden nur sehr wenige Sekundärelektronen abgestrahlt und die Probe lädt sich lokal negativ auf. Ist der Primärstrahl hingegen zu stark, können sich Teile der Oberfläche positiv aufladen.
    • Um diese Effekte zu vermeiden und somit die Bildgebung zu vereinfachen, werden Isolatoren meist vor ihrer elektronenmikroskopischen Untersuchung mit einer nur wenige Atomlagen dicken Gold- oder Kohlenstoffschicht überzogen. Diesen Vorgang bezeichnet man als Sputtern.

Auflösungsvermögen und Abbildungsfehler

  • Das Auflösungsvermögen eines Rasterelektronenmikroskops wird vor allem vom Durchmesser des abtastenden Primärelektronenstrahls bestimmt. Daneben spielen aber auch Faktoren wie die Eindringtiefe des Strahls in die Probe, die wiederum von der Materialbeschaffenheit der Probe und von der gewählten Beschleunigungsspannung der Primärelektronen abhängt, oder die Genauigkeit der Ansteuerung der einzelnen Rasterpunkte eine wichtige Rolle.
  • Für eine hohe Auflösung ist auch ein möglichst kreisrunder Querschnitt des Elektronenstrahls erforderlich. Dazu dienen die sogenannten Stigmatoren, zusätzliche Spulen in der Elektronenröhre, die elliptische Verzerrungen (Astigmatismus) des Primärelektronenstrahls korrigieren können.
  • Eine Beeinflussung des Strahlquerschnitts in der Ebene der Probenoberfläche erfolgt auch durch Beugungs-, Öffnungs- und Farbfehler in den strahlbündelnden Kondensorlinsen.
  • Insofern wird von diesen Abbildungsfehlern das Auflösungsvermögen beeinflusst, obwohl die eigentliche Abbildung des Objektes ohne Linsen geschieht.
  • Da im Raster-Elektronenmikroskop die Probe üblicherweise gegenüber der optischen Achse geneigt ist, kommt es zu einer Größenverzerrung senkrecht zur Kippachse.
  • Auf dem aufgenommenen Bild sind alle Objektdimensionen, die parallel zur x-Achse liegen, proportional zur Vergrößerung richtig dargestellt, während die von dieser Richtung abweichenden Objektdetails winkelabhängig verkleinert wiedergegeben werden. Diese Bildverzerrung muss bei morphometrischen Analysen berücksichtigt werden.

Messgrößen

Sekundärelektronen (SE)

  • Die historisch älteste und noch immer meistgenutzte Informationsquelle sind von Primärelektronen angeregte Elektronen aus dem Objekt, die dieses verlassen.
  • Diese sogenannten Sekundärelektronen haben eine Energie von einigen eV und werden durch sogenannte Everhart-Thornley-Detektoren gemessen.
    • Der Detektor "saugt" die freigesetzten Elektronen durch einen vorgesetzten, positiv geladenen Elektronenfänger regelrecht an. Jedes ankommende Elektron löst am Detektor eine Änderung seiner Ladung aus, dieses Signal wird anschließend weiterverstärkt und in älteren Geräten anschließend direkt in die Intensität der Anregungsspannung des schreibenden Elektronenstrahls einer Kathodenstrahlröhre moduliert, so dass auf diesem "Fernsehbild" direkt das Mikroskopbild abgebildet wurde. Durch Änderungen in der Verstärkung ließen sich Helligkeit und Kontrast verändern. Da die Abtastung durch den Elektronenstrahl im Mikroskop und das Schreiben des Bildes durch den Elektronenstrahl in der Bildröhre synchron erfolgen sind Echtzeitaufnahmen möglich.
    • Moderne Geräte digitalisieren ihre aufgenommenen Daten zunächst und visualisieren sie anschießend über Computer.
  • Der Kontrastmechanismus bei Sekundärelektronen basiert darauf, dass aus unterschiedlichen Teilen der Probe unterschiedlich viele Sekundärelektronen zum Detektor gelangen.
  • Besonders viele Elektronen erhält man aus erhabenen und schräg zum Primärelektronenstrahl sowie zum seitlich angeordneten Detektor stehenden Probenteilen. Diese Bereiche erscheinen auf dem SE-Bild hell, während Stellen mit geringerer Sekundärelektronenemission und solche, die gegenüber dem Elektronenfänger abgeschattet sind, dunkel bleiben.
  • Mit Sekundärelektronendetektoren aufgenommene Bilder erscheinen daher stets so, als sei die Probe von der Seite beleuchtet.
  • Da das Oberflächenvolumen, aus dem die Sekundärelektronen herausgelöst werden, vergleichsweise klein ist, erlauben solche Sekundärelektronenbilder sehr hohe Auflösungen bis hinab zu etwa 0,6 nm.
    • Diese Aussagen gelten allerdings nur, wenn mit extrem fein fokussiertem Primärelektronenstrahl und bei niedriger Beschleunigungsspannung gearbeitet wird. Ersteres ist wichtig, da beim Eindringen des Strahls in die Probe dieser eine erhebliche Aufweitung erfährt, letzteres da nur bei niedriger Beschleunigungsspannung die Eindringtiefe des Primärelektronenstrahls gering gehalten werden kann.
Schematische Darstellung der Auslösung von Sekundärelektronen und ihrer Wege zum Detektor
     1 : Primärelektronenstrahl
2 : Präparat
3 : Präparathalter
4 : Vom Elektronenfänger angezogene, herausgelöste Sekundärelektronen
5 : Elektronenfänger
6 : Elektronendetektor
 
A : Die Primärelektronen treffen senkrecht auf die Präparatoberfläche, dabei werden nur wenige Sekundärelektronen ausgelöst.
B : Die Primärelektronen treffen streifend auf die Präparatoberfläche, dabei entstehen mehr Sekundärelektronen.
C : Die Primärelektronen treffen - wie bei B - streifend auf die Präparatoberfläche, aber auf der vom Detektor abgewandten Seite. Von den zahlreich ausgelösten Sekundärelektronen gelangen nun aber weniger zum Elektronenfänger (Schatteneffekt).
 

 

 

 

 

SE-Bild eines Mikropartikels 

rem_se.gif (457861 Byte)

Backscattered Electrons (BSE)

  • Ein weiteres häufig genutztes Verfahren ist die Detektion von zurückgestreuten Elektronen (BackScattered Electrons, BSE).
  • Es handelt sich um vom Objekt reflektierte Primärelektronen mit, von der Einstrahlungsenergie abhängigen, Energien von einigen keV.
  • Die Größe der Oberfläche, in deren Bereich es zu derartigen Interaktionen kommt, ist stark von der Beschleunigungsspannung und dem Material des untersuchten Objektes abhängig.
    • Bei einer Energie der Primärelektronen von 20 kV liegt es bei etwa 1 µm, weshalb BSE-Bilder eine im Vergleich zu SE-Bildern deutlich schlechtere Auflösung zeigen.
  • In BSE-Bildern erscheinen tief liegende Bereiche des Objekts dunkel, wobei die Intensität des reflektierten Signals zusätzlich von der Ordnungszahl der Atome an der Objektoberfläche abhängt.
    • Schwere Elemente erzeugen eine starke Rückstreuung, so dass entsprechende Bereiche im BSE-Bild hell erscheinen.
    • Mit Hilfe der von BSE-Bildern können so Rückschlüsse auf die chemische Zusammensetzung der Objektoberfläche gezogen werden.
BSE-Bild eines Mikropartikels 

rem_bse.gif (688735 Byte)

Auger-Elektronen

Charakteristische Röntgenstrahlung

  • Die verbreitete Methode der Erfassung und Auswertung der charakteristischen Röntgenstrahlung ist die energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX), bei der Energie der freigesetzten Röntgenquanten ausgewertet wird.
  • Alternativ ließe sich aber auch die wellenlängendispersive Röntgenspektroskopie (Wavelength Dispersive X-Ray Analysis, WDX) einsetzen.

Absorbierte Elektronen

  • Absorbierte Elektronen stellen einen durch die Probe zur Erde abfließenden Strom dar. Dieser kann für jeden Punkt des Rasters einzeln gemessen und ausgewertet werden.
  • Aus den Einzelpunkten lässt sich auch hier eine Abbildung der Oberfläche erstellen.

Kathodolumineszenz

  • Einige Stoffe emittieren beim Bestrahlen mit energiereichen Elektronen Licht. Dieses Phänomen wird als Kathodolumineszenz bezeichnet.
  • Die entstehenden Photonen werden mit Hilfe eines Hohlspiegels aufgefangen und verstärkt.
  • Da das Energiemuster der erzeugten Photonen charakteristisch für bestimmte Elemente / Moleküle ist, kann das abgestrahlte Licht spektral zerlegt und frequenzselektiv ausgewertet werden. 
  • Mit Hilfe der Kathodolumineszenzstrahlung lassen sich somit bei geeigneten Proben Informationen zu Intern- und Defektstruktur, sowie Spurenelementen gewinnen.

Probenpräparation

Präparatmontage

  • In der Rasterelektronenmikroskopie verwendet man massive Metallplättchen, die mit einem Fuß in eine entsprechende Öffnung des Probentisches gesteckt werden, als Objektträger. 
  • Die Montage der Präparate geschieht im allgemeinen durch Aufkleben. An die verwendeten Klebstoffe ist die Anforderung zu stellen, dass sie im Vakuum nicht ausgasen.
    • Im Interesse einer verbesserten Leitfähigkeit der Probe können elektrisch leitende Klebstoffe eingesetzt werden, z.B. Leitsilber oder Leitcarbon.
    • Für viele Präparate reicht jedoch die Verwendung einfachen doppelseitigen Klebebandes aus.
  • Bei der Montage sollte bereits berücksichtigt werden, dass die interessierenden Strukturen auch vom abrasternden Primärstrahl erreicht werden können, d.h. nach oben gekehrt sein müssen.

Erzeugung elektrischer Leitfähigkeit ("Sputtern")

  • Elektrisch schlecht oder nichtleitende Proben laden sich durch das Eindringen des abtastenden Elektronenstrahls zunehmend negativ auf, was die Abbildung erheblich stören kann, da diese Bereiche zunehmend heller werden und überstrahlen.
  • Zur Verbesserung der elektrischen Leitfähigkeit werden solche Proben daher mit elektrisch leitenden Substanzen beschichtet, sodass die eingebrachte Ladung über die Probenoberfläche und den metallischen Probenhalter in den geerdeten Probentisch abfließen kann. 
  • Der Prozess der Beschichtung wird als "Sputtern", vom englischen Ausdruck "sputter-coating" bezeichnet. 
    • Bei diesem Verfahren prallen durch Gasentladung erzeugte Argonionen auf eine Kathode aus dem Material, das zur Beschichtung eingesetzt werden soll (meist Gold oder Kohlenstoff, aber auch z.B. Platin), und schlagen dort Atome heraus, die sich nun u.a. auf der Probenoberfläche ablagern. Dadurch entsteht eine gut leitende und zusammenhängende Schicht, die im Idealfall so dünn ist, dass sie unter dem Auflösungsvermögen des Mikroskops liegt und somit die Abbildung der Probenoberfläche nicht verfälscht.
      • Für die bildgebende Elektronenmikroskopie wird meist Gold eingesetzt, da dieses hohe Leitfähigkeit bereits in dünnen Schichten garantiert. 
      • Für EDX-Analysen bevorzugt man meist Kohlenstoff als Beschichtungsmaterial, da dessen Eigensignal die Analyse meist weniger stört. 

Fixierung (bei biologischen Proben)

  • Da im Rasterelektronenmikroskop aufgrund des Hochvakuums keine lebenden Proben ausgewertet werden können, kommt der Fixierung biologischer Proben eine große Bedeutung zu.
  • Grundsätzlich können postmortale Veränderungen der Struktur biologischer Proben sowohl durch chemische als auch durch physikalische Fixierung klein gehalten werden. 
    • Zur chemischen Fixierung haben sich Aldehyde, wie z.B. Glutaraldehyd oder Formaldehyd bewährt. Neben diesen gilt auch Osmiumtetroxid (OsO4) als ein gutes strukturerhaltendes Mittel. 
      • Die Fixation erfolgt in verdünnter wässriger Lösung dieser Substanzen, die zur Vermeidung von Schrumpfungen bzw. Quellungen den gleichen osmotischen Druck aufweisen muss, wie das zu fixierende Gewebe (Isotonie). Weiterhin ist darauf zu achten, dass der pH-Wert der Fixierlösung mit dem des Gewebes übereinstimmt. Er sollte sich während der Fixation nicht verändern, wozu eine wirksame Pufferung des Fixiergemisches erforderlich ist.

Entwässerung und Trocknung (insbesondere bei biologischen Proben)

  • Das einfache Trocknen biologischer Präparate durch Verdunstung des Wassers führt zu starken Strukturzerstörungen aufgrund der Einwirkung von Oberflächenspannungen. Ein zunächst durchgeführter Austausch des Wassers gegen Flüssigkeiten mit geringerer Oberflächenspannung (sogenannte Entwässerung) und mit anschließender Trocknung durch Verdunstung der Substitutionsflüssigkeit bringt meist nur geringfügig bessere Ergebnisse. 
  • Erstrebenswert ist daher eine Trocknung, bei der die störende Oberflächenspannung überhaupt nicht auftritt. Dies lässt sich durch eine Trocknung jenseits des "kritischen Punktes" erreichen. 
    • Bei der "Kritischen-Punkt-Trocknung" (KPT bzw. englisch: CPD von "critical point drying") wird das Wasser der Proben zunächst durch Alkohol substituiert. 
    • Anschließend werden die Proben in eine Druckkammer überführt, in der der Alkohol schrittweise durch CO2, das bei Zimmertemperatur bereits bei einem Druck von etwa 55 bar flüssig ist, verdrängt wird.
    • Ist die Probe vollständig mit reinem CO2 durchtränkt und umgeben, kann die Temperatur in der Druckkammer erhöht werden. Damit steigt auch der Druck in der Kammer an. 
    • Liegen Druck und Temperatur über den kritischen Werten, wird der Druck gesenkt, wobei die Temperatur weiterhin über der kritischen Temperatur bleiben muss. 
    • Sobald der Normaldruck erreicht ist, kann die Probe getrocknet entnommen werden.

Weitere Präparationsverfahren (insbesondere für biologische Proben)

  • Für die Abbildung innerer Oberflächen sind kompliziertere Verfahren erforderlich.
  • Entweder kann man sie durch gezieltes Freilegen erfassbar machen (meist mittels Sprödbruchpräparation) oder man gießt sie zunächst mit einem Abdruckmaterial aus und entfernt anschließend das umliegende Gewebe (Korrosionsabdruck).
    • Bei der Sprödbruchtechnik wird die Probe mit flüssigem Stickstoff extrem schnell und stark heruntergekühlt. Die dadurch sehr spröde Probe wird nun aufgebrochen, wobei die Bruchstücke weiterhin die Oberflächenstrukturen der ungefrorenen Probe tragen. Danach kann die Probe wieder aufgetaut und evtl. andere Präparationstechniken unterzogen werden.
    • Für die Korrosionstechnik werden die zu untersuchenden Strukturen nach einer Vorreinigung mit einer Monomer-Lösung gefüllt, die anschließend zur Polymerisation gebracht wird. So erhält man einen Polymerabdruck der hohlen Bereiche der Probe.
 

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