Dünnschichtchromatographie (DC)
Synonyme
- Thin Layer Chromatography (TLC)
Trennprinzip
Aufbau
Stationäre Phase
- Kieselgel
- Die eigentliche stationäre Phase ist meist Kieselgel. Da Kieselgel
auf den meist als Träger verwendeten Glasplatten jedoch nur schlecht
haftet, wird oftmals Gips (CaSO4) als "Kleber"
beigemengt. Diese Platten werden mit einem "G" im Namen
gekennzeichnet, Platten mit reinem Kieselgel tragen den Zusatz
"H".
- Zur vereinfachten Auswertung der Chromatogramme sind auch Platte mit
"eingebautem" Fluoreszenzindikator erhältlich, die den
Namenszusatz "F" sowie eine Zahl tragen. Die Zahl entspricht
der Anregungswellenlänge in nm des Indikators, z.B. 254 nm. Der
Indikator fluoresziert meist in hellgrün, an den Substanzflecken findet
keine Fluoreszenz
statt, da hier das UV-Licht absorbiert wird bevor es den Indikator
erreichen kann; diese Stellen erscheinen folglich dunkel. Dieses auf
Verfahren wird, vom Prinzip her falsch, als
"Fluoreszenzlöschung" bezeichnet. Es funktioniert bei allen
Stoffen, die Chromophore
aufweisen, die im Bereich der Anregungswellenlänge des Indikators
absorbieren, z.B. Aromaten,
Verbindungen mit Carbonylfunktionen etc.
- Die Aktivität des Kieselgels wird stark von seinem Wassergehalt
beeinflusst; durch steigenden Wassergehalt sinkt die Aktivität ab, der
RF-Wert steigt. Dies kann u.U. zur Verbesserung der Wanderung
der Probe eingesetzt werden, allerdings ist dieser Einfluss umso
geringer, je polarer das verwendete Fließmittel ist.
- Die Änderung der Schichtaktivität verändert auch die Selektivität
der Schicht, die Trennleistung und die Auflösung.
- Für die Wechselwirkungen mit der Probe sind polare OH-Gruppen an der
Oberfläche verantwortlich.
- Das eingesetzte Kieselgel weist eine sehr große Oberfläche auf, die
neben der kleinen Partikelgröße auch auf relativ großen (600 - 800
nm) Poren beruht.
- Die Trennleistung kann durch den Einsatz sehr feinkörniger
Materialien mit möglichst einheitlicher Korngrößenverteilung deutlich
erhöht werden. Dies wird in der HPTLC
ausgenutzt.
- Aluminiumoxid
- Aluminiumoxid wird nur noch vereinzelt eingesetzt.
- Kieselgur
- Im Gegensatz zu Kieselgel ist Kieselgur nahezu unpolar.
- Cellulose
- Beim Einsatz von Cellulose als stationärer Phase handelt es sich
praktisch ausschließlich um Verteilungschromatographie, die Adsorption
spielt nahezu keine Rolle mehr.
Fließmittel
- Das Fließmittel bildet nach der Gleichgewichtseinstellung mit dem Sorbens
die trennwirksame mobile Phase. Es entscheidet im Zusammenwirken mit der
stationären Phase über Selektivität und Trennleistung des Systems.
- In der Adsorptionschromatographie konkurrieren die Substrat- und
Fließmittelmoleküle um die aktiven Zentren der stationären Phase.
- Die Auswahl des Fließmittels erfolgt anhand der eluotropen
Reihe.
- Je stärker die Elutionskraft eines Fließmittels ist, desto schwächer
sind die Wechselwirkungen der Probe mit der stationären Phase; folglich
steigt der RF-Wert an.
- Sind polare Substanzen zu trennen, so werden polare Fließmittel, sind
unpolare Substanzen zu trennen, werden unpolare Fließmittel eingesetzt.
- Problematisch ist die Fließmittelwahl unter Umständen bei Substanzen,
die weder richtig unpolar, noch richtig polar sind. Hier lässt sich die
Trennung oftmals durch mehrfache Entwicklung der Platte mit verschiedenen
Fließmitteln verbessern. Allerdings werden dabei u.U. bereits gut getrennte
Substanzen wieder schlechter aufgelöst.
- Meist steigert man die Polarität des Fließmittels zwischen den einzelnen
Entwicklungen, da bei der Verwendung von "normalem" Kieselgel die
stationäre Phase immer polar ist und so durch eine Erhöhung der Polarität
des Fließmittels sich die Laufstrecke der Substanzen erhöhen lässt, da
nun die Wechselwirkungen zwischen stationärer Phase und Probe stärker
gestört werden.
Ablauf einer DC
- Die stationäre Phase ist auf einen Träger, z.B. Glas, Kunststoff oder
Aluminiumfolie aufgetragen.
- Diese chromatographische Platte muss unbeschädigt sein und wird nun
vorsichtig mit Bleistift markiert (Startpunkte, Laufstrecke). Dabei sind die
Startpunkte in einem Abstand von min. 15 mm von der Unterkante der Platte
parallel zu dieser und ebenso weit voneinander entfernt aufzutragen.
Oberhalb der Laufstreckenmarkierungen werden de Substanzen und
experimentellen Daten notiert.
- Anschließend werden die vorbereiteten Lösungen mittels graduierter
Kapillaren aufgetragen. Je kleiner der Startfleck ist, desto besser ist das
Trennergebnis.
- Nach dem Auftragen bleibt die Platte ca. 10 min an der Luft liegen, um die
Lösemittel verdampfen zu lassen, erst danach wird die Platte entwickelt.
- Die Entwicklung erfolgt indem die Platte aufrecht in die vorbereitete
Chromatographierkammer gestellt wird. Für übliche Chromatographierkammern
werden 100 - 200 ml Fließmittel benötigt. Die Atmosphäre in der Kammer
muss vor Beginn der Trennung mit Fließmittel gesättigt werden, um die
Trennergebnisse nicht durch Verdunstungseffekte zu verfälschen. Dazu wird
die Kammer mit Filterpapier ausgekleidet, das mit dem Fließmittel getränkt
ist und abgedeckt ca. 15 min stehen gelassen.
- Die Platte muss so ins Fließmittel gestellt werden, dass alle
Startflecken genau parallel zur Flüssigkeitsoberfläche sind.
- Während der Entwicklung ist die Kammer geschlossen und vor Zugluft sowie
Wärmequellen geschützt zu halten.
- Wenn das Fließmittel die zuvor aufgetragene Markierung der Laustrecke
erreicht hat, wird die Platte aus der Kammer genommen und an der Luft
getrocknet.
- Anschließend erfolgt die Auswertung bzw. Detektion.
Auswertung
- Qualitativ
- Betrachtete Parameter sind die Laufstrecke, die Farbe / Intensität
und das UV-Verhalten.
- Sicherste Methode ist der direkte Vergleich mit einer die
Probesubstanz enthaltenden Referenz auf der gleichen Platte. Sollte dies
nicht möglich sein, kann mit Hilfe folgender Werte gearbeitet werden:
- RF-Wert
- Abkürzung für englisch "retention factor"
- Der RF-Wert ist der Quotient aus dem zurückgelegten
Weg der Substanz und dem des Fließmittels.
- Er ist abhängig von äußeren Bedingungen wie Luftfeuchtigkeit,
Temperatur etc.
- Der RF-Wert muss kleiner oder gleich eins sein.
- RSt-Wert
- Abkürzung für englisch "retention standard"
- Der RSt-Wert gibt das Verhältnis des zurückgelegten
Weges der Substanz zu dem einer Referenzsubstanz an.
- Je nach Vergleichslösung kann er Werte von unter oder über eins
annehmen.
- Semiquantitativ
- Vergleich der auch zur qualitativen Auswertung herangezogenen
Parameter mit einer Referenz bekannter Konzentration
- Da zwischen der Fleckgröße und der Masse ein Zusammenhang besteht ()
wird die halbquantitative Auswertung im Arzneibuch auch als direkter
Reinheitsnachweis eingesetzt. Voraussetzung dafür ist jedoch ein RF-Wert
zwischen 0,3 und 0,5.
- Quantitativ
- direkt
- Densiometrie
- Spektralphotometrie
- Radiometrie
- Szintillationsmessung
- indirekt (nach Extraktion)
Detektion
- Ohne chemische Reaktion durch
- Eigenfarbe
- Fluoreszenz
(bei UV-Bestrahlung)
- Fluoreszenzminderung (bei in der DC-Platte vorhandenem
Fluoreszenzindikator)
- Farbreaktion auf der Schicht
- Vorgehen
- Aufsprühen von Reagenzien
- Baden der Platte in einer Reagenzlösung
- "Räuchern" mit gasförmigen Reagenzien
- Unspezifische Nachweise organischer Verbindungen
- Ioddampf (braune Flecke, unspezifisch, da nur durch Anlagerung
entstehend)
- Kaliumpermanganat (farblose Flecke auf violettem Untergrund, da
nur an den Substanzflecken MnO4- zu Mn2+
reduziert wird, relativ unspezifisch)
- Nachweis funktioneller Gruppen:
- Nachweis von Substanzklassen:
Leistungsbewertung
- Nachweisgrenze im ng-Bereich, gute Trennleistung, schnelle
Durchführbarkeit, gute Reproduzierbarkeit.
- Diese guten Eigenschaften werden in der HPTLC
noch einmal verbessert.
- Gute Detektierbarkeit.
- Relativ teure Verbrauchsmaterialien (Platten, hochreine Fließmittel).
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